A restrikciós enzimek olyan enzimek, amelyek mind egy-, mind kettős szálú DNS-t vágnak. Mindegyik restrikciós enzimnek specifikus nukleotidszekvenciája van, amelyet restrikciós helynek neveznek, amelyet felismer és vág. A restrikciós enzimeket DNS-szekvenáláshoz, mutációs analízishez, DNS-klónozáshoz és amplifikációhoz használják. A tudósok restrikciós enzimeket használnak a kérdéses gének beillesztésére expressziós vektorokká, olyan DNS-molekulákká, amelyek a kromoszomális DNS-től külön-külön reprodukálhatók. A kérdéses gént tartalmazó vektort ezután baktériumtörzsbe vezetjük a fehérjék expressziójához és jellemzéséhez.
A nap videója
1. lépés
Határozza meg a restrikciós enzim helyeket a vektorban egy restrikciós térképen. A restrikciós térkép megmondja, mely enzimek vágják le a vektort, és hol.
2. lépés
Válasszon egy olyan restrikciós enzimet, amely a génbetétben is van jelen egy webhelyen, figyelve a betét sorrendjét. Győződjön meg róla, hogy a restrikciós hely olyan pozícióban van, amely a génen kívüli betéten található, így nem veszítheti el a gén egy részét.
3. lépés
Győződjön meg róla, hogy a restrikciós helynek nincsenek megjegyzései bárhol a génbetétben vagy a vektorban. Ez többszörös vágást okoz a DNS-ben, és félrevezető adatokat ad.
4. lépés
Próbáld meg kiválasztani a restrikciós enzimeket, amelyek ragacsos végekkel vágnak, nem pedig tompa véget. Ragadós végek akkor fordulnak elő, amikor az enzim kettős szálú DNS-t vágja el szakaszosan, egyszálú túlnyúlást hagyva, amely megkönnyíti a kapcsolódást az ellentétes vágott betéttel. Blunt végek akkor fordulnak elő, amikor a kettős szálú DNS-t sima módon vágják, és ezeket nehezebb rögzíteni.
5. lépés
Válasszon egy másik restrikciós enzimet a betét mindkét végén, hogy biztosítsa, hogy a vektorba a megfelelő orientációba illeszkedjen, és biztosítsa, hogy a vektor ne kapcsolódjon vissza önmagához.
6. lépés
Válasszon két olyan restrikciós enzimet, amelyek jól működnek ugyanabban a pufferrendszerben és hőmérsékleten. Ha ez nem lehetséges, futtassa külön az egyes emésztéseket.
A szükséges dolgok
- A génbetét szekvenciája
- Kiválasztott vektor restrikciós térképe
- A restrikciós enzimek és a vágott területek felsorolása
Tippek
- Néhány internetes programot fejlesztettek ki azonosítani gyorsan restrikciós helyeket egy DNS-szekvencián. Az egyik ilyen program a New England BioLabs.
